Аннотация:
Цель. Разработка ускоренного способа генодиагностики дифтерии на основе изотермальной амплификации для выявления ДНК возбудителя. Материалы и методы. Исследование проводилось на типовых коллекционных штаммах из «ГКПМ-Оболенск», а также на 135 штаммах С. diphtheriae, выделенных в бактериологических лабораториях субъектов РФ и присланных в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Выделение штаммов проводили по МУ 4.2.698-98 и МУК 4.2.3065-13. Хромосомную ДНК выделяли стандартным методом кипячения, а также с помощью трех коммерческих наборов. Детекцию результатов амплификации осуществляли в горизонтальном электрофорезе в 1,5[%] агарозном геле. Результаты. Установлено, что разработанный способ генодиагностики позволяет выявлять ДНК токсигенных штаммов C.diphtheriae двух биоваров, а также ДНК нетоксигенных токснесущих штаммов C.diphtheriae биовара mitis с механизмами отсутствия экспрессия гена дифтерийного токсина, обусловленными наличием делеции или мобильного генетического IS элемента в гене tox. Нетоксигенные токонесущие штаммы С. diphtheriae с механизмом отсутствия экспрессия гена дифтерийного токсина, обусловленным наличием транспозона в гене tox, идентифицируются как нетоксигенные. Оценка аналитической чувствительности в сравнительных исследованиях при использовании трех коммерческих наборов для выделения ДНК показала, что с помощью набора «Рибо-преп» чувствительность достигала 4,5x10[sup]1[/sup] ГЭ/мл. Показана высокая специфичность разработанного способа, которая оценивалась на 18 штаммах 16 других представителей рода Corynebacterium и 20 типовых штаммах микроорганизмов, выделенных из ротоглотки или вызывающих заболевания дыхательных путей. Апробация разработанного способа проведена в модельных экспериментах на иммитантах клинических образцов путем заражения одноразовых стерильных сухих тампонов последовательными разведениями бактериальной культуры (с параллельным высевом на плотные питательные среды) и составила 10[sup]3 [/sup]ГЭ/мл. Заключение. Разработанный способ ускоренной генодиагностики дифтерийной инфекции обладает высокой диагностической эффективностью, специфичностью и чувствительностью, позволяет выявлять 10[sup]3[/sup] - 4,5x10 ГЭ/мл C.diphtheriae в клиническом материале с одновременной верификацией токсигенных и нетоксигенных штаммов.
Aim. Development of an accelerated method of gene diagnostics of diphtheria based on isothermal amplification for detection of DNA of the causative agent. Materials and methods. The study was carried out in typical collection strains from GKPM-Obolensk, as well as in 135 strains of C. diphtheriae isolated from bacteriological laboratories of the regions of Russian Federation and sent to the Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology Strain isolation was carried out in accordance with Ml 4.2.698-98 and 4.2.3065-13. Chromosomal DNA was isolated by standard heating method, as well as using 3 commercial kits. Detection of the amplification results was carried out in horizontal electrophoresis in 1.5[%] agarose gel. Results. The developed method of gene diagnostics was established to allow detection of DNA of toxigenic C. diphtheriae strains of 2 biovars, as well as DNA of non-toxigenic tox-gene bearing strains (NTTB) of C. diphtheriae mitis biovar with mechanisms of lack of expression of diphtheria toxin gene due to the presence of deletion or mobile genetic IS element in the tox gene. Non-toxigenic tox-gene bearing C. diphtheriae strain with the mechanism of lack of diphtheria toxin gene expression due to the presence of transposon in the tox gene are identified as non-toxigenic. Evaluation of the analytical sensitivity in comparative studies using 3 commercial kits for FNA isolation has shown that sensitivity reached 4.5x 10<sup>1</sup> GE/ml using Ribo-prep kit. H igh specificity of the developed method is shown, it was evaluated in 18 strains of 16 other members of the Corynebacterium genus and 20 typical strains of microorganisms isolated from oropharynx or causing infections of the respiratory tract. Approbation of the developed method was carried out in model experiments in imitators of clinical samples by infection of single-use sterile dry tampons by consecutive dilutions of the bacterial cultures (with parallel seeding into dense nutrient media) and was 10<sup>3</sup> GE/ml. Conclusion. The developed method of accelerated gene diagnostics of the diphtheria infection has a high diagnostic effectiveness, specificity and sensitivity, allows to detect 10<sup>3</sup> - 4.5x10 GE/ml C. diphtheriae in clinical material with simultaneous verification of toxigenic and non-toxigenic strains. Борисова О.Ю. Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского, Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова
Пименова А.С. Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского
Чаплин А.В. Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского, Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова
Кафарская Л.И. Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского
Афанасьев С.С. Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского
Алешкин В.А. Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского
Алешкин А.В. Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского
Афанасьев М.С. «Первый Московский государственный университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет)
Караулов А.В. «Первый Московский государственный университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет)
Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского, Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова
Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Pirogov Russian National Research Medical University
Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского
G.N. Gabrichevsky Scientific Research Institute for Epidemiology and Microbiology
«Первый Московский государственный университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет)
Sechenov First Moscow State Medical University
Borisova O.Y. O. Yu. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Pirogov Russian National Research Medical University
Pimenova A.S. G.N. Gabrichevsky Scientific Research Institute for Epidemiology and Microbiology
Chaplin A.V. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Pirogov Russian National Research Medical University
Kafarskaya L.I. G.N. Gabrichevsky Scientific Research Institute for Epidemiology and Microbiology
Afanasiev S.S. G.N. Gabrichevsky Scientific Research Institute for Epidemiology and Microbiology
Aleshkin V.A. G.N. Gabrichevsky Scientific Research Institute for Epidemiology and Microbiology
Aleshkin A.V. G.N. Gabrichevsky Scientific Research Institute for Epidemiology and Microbiology
Afanasiev M.S. Sechenov First Moscow State Medical University
Karaulov A.V. Sechenov First Moscow State Medical University
AN ACCELERATED METHOD OF DIPHTHERIA GENE DIAGNOSTICS BASED ON ISOTHERMAL AMPLIFICATION TO DETECT DNA OF THE CAUSATIVE AGENT eng
УСКОРЕННЫЙ СПОСОБ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИИ НА ОСНОВЕ ИЗОТЕРМАЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ
Текст визуальный электронный
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии
Central Research Institute for Epidemiology
Т. 94, № 5 С. 24-32
2017
дифтерия
pertussis
диагностика
diagnosis
C.diphtheriae
дифтерия
diphtheria
C. diphtheriae
C. diphtheriae
изотермальная амплификация
изотермальная амплификация
isothermal amplification
isothermal amplification
ДИАГНОСТИКА
DIAGNOSTICS
Статья
Цель. Разработка ускоренного способа генодиагностики дифтерии на основе изотермальной амплификации для выявления ДНК возбудителя. Материалы и методы. Исследование проводилось на типовых коллекционных штаммах из «ГКПМ-Оболенск», а также на 135 штаммах С. diphtheriae, выделенных в бактериологических лабораториях субъектов РФ и присланных в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Выделение штаммов проводили по МУ 4.2.698-98 и МУК 4.2.3065-13. Хромосомную ДНК выделяли стандартным методом кипячения, а также с помощью трех коммерческих наборов. Детекцию результатов амплификации осуществляли в горизонтальном электрофорезе в 1,5[%] агарозном геле. Результаты. Установлено, что разработанный способ генодиагностики позволяет выявлять ДНК токсигенных штаммов C.diphtheriae двух биоваров, а также ДНК нетоксигенных токснесущих штаммов C.diphtheriae биовара mitis с механизмами отсутствия экспрессия гена дифтерийного токсина, обусловленными наличием делеции или мобильного генетического IS элемента в гене tox. Нетоксигенные токонесущие штаммы С. diphtheriae с механизмом отсутствия экспрессия гена дифтерийного токсина, обусловленным наличием транспозона в гене tox, идентифицируются как нетоксигенные. Оценка аналитической чувствительности в сравнительных исследованиях при использовании трех коммерческих наборов для выделения ДНК показала, что с помощью набора «Рибо-преп» чувствительность достигала 4,5x10[sup]1[/sup] ГЭ/мл. Показана высокая специфичность разработанного способа, которая оценивалась на 18 штаммах 16 других представителей рода Corynebacterium и 20 типовых штаммах микроорганизмов, выделенных из ротоглотки или вызывающих заболевания дыхательных путей. Апробация разработанного способа проведена в модельных экспериментах на иммитантах клинических образцов путем заражения одноразовых стерильных сухих тампонов последовательными разведениями бактериальной культуры (с параллельным высевом на плотные питательные среды) и составила 10[sup]3 [/sup]ГЭ/мл. Заключение. Разработанный способ ускоренной генодиагностики дифтерийной инфекции обладает высокой диагностической эффективностью, специфичностью и чувствительностью, позволяет выявлять 10[sup]3[/sup] - 4,5x10 ГЭ/мл C.diphtheriae в клиническом материале с одновременной верификацией токсигенных и нетоксигенных штаммов.
Aim. Development of an accelerated method of gene diagnostics of diphtheria based on isothermal amplification for detection of DNA of the causative agent. Materials and methods. The study was carried out in typical collection strains from GKPM-Obolensk, as well as in 135 strains of C. diphtheriae isolated from bacteriological laboratories of the regions of Russian Federation and sent to the Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology Strain isolation was carried out in accordance with Ml 4.2.698-98 and 4.2.3065-13. Chromosomal DNA was isolated by standard heating method, as well as using 3 commercial kits. Detection of the amplification results was carried out in horizontal electrophoresis in 1.5[%] agarose gel. Results. The developed method of gene diagnostics was established to allow detection of DNA of toxigenic C. diphtheriae strains of 2 biovars, as well as DNA of non-toxigenic tox-gene bearing strains (NTTB) of C. diphtheriae mitis biovar with mechanisms of lack of expression of diphtheria toxin gene due to the presence of deletion or mobile genetic IS element in the tox gene. Non-toxigenic tox-gene bearing C. diphtheriae strain with the mechanism of lack of diphtheria toxin gene expression due to the presence of transposon in the tox gene are identified as non-toxigenic. Evaluation of the analytical sensitivity in comparative studies using 3 commercial kits for FNA isolation has shown that sensitivity reached 4.5x 10<sup>1</sup> GE/ml using Ribo-prep kit. H igh specificity of the developed method is shown, it was evaluated in 18 strains of 16 other members of the Corynebacterium genus and 20 typical strains of microorganisms isolated from oropharynx or causing infections of the respiratory tract. Approbation of the developed method was carried out in model experiments in imitators of clinical samples by infection of single-use sterile dry tampons by consecutive dilutions of the bacterial cultures (with parallel seeding into dense nutrient media) and was 10<sup>3</sup> GE/ml. Conclusion. The developed method of accelerated gene diagnostics of the diphtheria infection has a high diagnostic effectiveness, specificity and sensitivity, allows to detect 10<sup>3</sup> - 4.5x10 GE/ml C. diphtheriae in clinical material with simultaneous verification of toxigenic and non-toxigenic strains.